癌症作為一種細胞異常增殖的疾病

是全球主要的公共衛生問題

近日♣︎，意昂杜鵬課題組揭示

植物免疫蛋白通過挽救miRNA缺陷

實現廣譜抗腫瘤反應

這一發現為人類戰勝癌症

提供了強大武器

一、誘發癌症的罪魁禍首

癌症的誘因非常復雜，是胞內多種調控通路的突變和微環境共同作用的結果，其中微小RNA（miRNA）是近年來被認為與癌症發生息息相關的重要RNA分子🚅。在哺乳動物中，具有2-nt 3'末端懸垂的成熟miRNA雙鏈可以被Argonaute（AGO）識別並裝載形成RNA誘導的沉默復合體（RISC）進而調控靶基因的表達。在癌症中，全局miRNA劑量減少被認為是癌症發生的誘因之一。然而🫃🏿，迄今為止對於不同癌症中普遍miRNA缺乏的原因尚未被系統陳述🪫🍮。

細胞周期的過度激活是癌細胞異常增殖的必要條件🧤，因此細胞周期基因是抗癌藥物研發的重要靶點。現有細胞周期的藥物往往只能針對一種或者幾種靶點🧜🏿‍♂️，因而無法克服基因冗余性而帶來的耐藥性🧜‍♀️。有意思的是💃🏽，許多miRNA都可以直接靶向並抑製細胞周期基因，從而直接控製細胞增殖✮💿。因此，能否通過修復腫瘤中有缺陷的miRNA通路從而實現對於腫瘤細胞增殖的抑製😸，就一直是一個懸而未決的生物學問題。一旦成功，則可開發成為一種腫瘤治療的新策略🧖🏿‍♀️👨🏿‍🦳。

與miRNA不同，siRNA來源於不同RNA依賴性RNA聚合酶 (RDR) 合成的雙鏈RNA底物。有趣的是👩🏽‍⚕️，RDR幾乎在所有真核生物中都已被發現🧗🏼‍♀️，但在進化過程中👩🏼‍🍼，其在具有次級免疫系統的脊椎動物中丟失🧑🏽‍🦲。在植物中👨🏻‍⚖️，依賴RDR1的siRNA尤其參與抗病毒免疫反應，是植物特有的、最核心的分子免疫反應通路之一。近年來，跨物種生物工程已成功應用於基礎研究和轉化醫學🏡，例如來自細菌的Crispr-Cas👨🏼‍🌾。因此，意昂官网嘗試從動植物免疫系統的差異出發，在哺乳動物中進行基於植物RDR1的植物基因工程⛹️‍♀️，並研究其相關的轉化醫學的應用。

2022年5月26日👨🏼‍🏭🛐，意昂官网杜鵬課題組在Cell雜誌在線發表了題為“A plant immune protein enables broad antitumor response by rescuing microRNA deficiency” 的研究論文🫄。該研究發現：

在不同的人類原發性癌症樣本和癌症細胞系中,不能有效結合AGO2復合體的3’末端短1-nt的miRNA異構體廣泛積累0️⃣。異位表達的植物免疫蛋白RDR1通過其單核苷酸加尾修飾這些AGO2遊離出的miRNA雙鏈異構體🫃，以重新激活有缺陷的miRNA通路，從而特異性阻斷實體瘤和白血病中癌細胞的細胞周期🦣。

二、振奮人心的研究結果

在本研究工作中✹，作者主要有以下4個發現：

RDR1蛋白通過靶向細胞周期廣泛抑製癌細胞的增殖

為了在哺乳動物細胞中進行基於植物RDR1的生物工程⚀，作者分別從擬南芥（At）和水稻（Os）中克隆RDR1基因到基於Dox誘導的慢病毒載體上。最終，本研究獲得了13個穩定的RDR1誘導細胞系（包括7個實體瘤🏌🏼‍♀️、3個白血病、3個非癌症細胞系）和2個RDR1恒定表達的胚胎幹細胞系🌊。通過Western blot和活細胞成像👨🏼‍🍳，作者驗證了RDR1在哺乳動物細胞中成功實現了異位表達。

在接下來的研究中，令作者驚訝和意外的是，AtRDR1和OsRDR1能夠在體外顯著抑製所有10種癌症細胞系的增殖👩🏽‍⚖️，但對其他5種非癌細胞沒有影響🤑。RDR1還可以顯著抑製癌細胞的克隆形成能力。在分子水平上👓🪺，基於RNA-seq的基因集富集分析（GSEA）表明，AtRDR1和OsRDR1可以幹擾所有癌症細胞系中的細胞周期過程，但在非癌對照細胞中沒有明顯作用。

值得註意的是，短時間（2-3天）誘導RDR1同樣可顯著抑製癌細胞中的細胞周期過程👳🏿，表明細胞周期通路可能是RDR1的直接作用靶點✦。隨後，EdU/PI染色分析顯示，RDR1在癌細胞中的表達顯著降低了S期的細胞比例，反而增加了G0/G1期的細胞比例。因此🔜，作者認為植物免疫蛋白RDR1是一種外源腫瘤抑製因子，它能夠特異靶向並幹擾癌細胞中的細胞周期過程，但在非癌症細胞中卻不起作用。

AtRDR1和OsRDR1廣譜且特異的抑製癌細胞增殖，但不影響非癌細胞系

RDR1能夠特異靶向並幹擾癌細胞的細胞周期🐬，但對非癌細胞不起作用

3’末端短1-nt的miRNA異構體在多種腫瘤中廣泛積累

由於RDR1參與植物中的小RNA通路，作者在RDR1誘導表達前後的癌症和非癌症細胞中進行小RNA測序。令人驚訝的是💋👩🏽‍🚀，作者發現誘導RDR1後的癌症細胞中miRNA的整體表達明顯增加𓀝，但在非癌症細胞系中卻沒有出現這種現象。隨後，作者還通過miRNA通路關鍵組分的敲低和AGO2-CLIP等實驗，提出植物RDR1通過提高全局miRNA表達以特異挽救癌細胞中的miRNA缺乏來抑製細胞周期和增殖🙆🏿‍♂️。

為了進一步研究RDR1特異靶向癌細胞的機製🏙，作者對已公開發表的小RNA測序數據進行系統分析，包括TCGA數據庫的9980組癌症病人數據以及GEO數據庫的癌症病人🧚‍♀️、癌症細胞系以及正常組織的數據。結果表明，在很多癌症病人和細胞系的樣本中，在3’末端短1-nt的miRNA異構體出現了大量的積累（圖3）。這些3’末端短1-nt的miRNA在部分癌症樣本中甚至成為不同miRNA異構體中數量最多的群體（圖3）。由於AGO蛋白結構的特殊性，2-nt懸垂的結構有利於miRNA雙鏈進入AGO2中形成RISC[6]🍘。作者提出➰，這種1-nt懸垂的異構體，相比於2-nt懸垂的異構體進入AGO2的效率更低🫰🏽，並通過EMSA和MST實驗進行了驗證。同時，通過AGO2-IP的小RNA測序，作者進一步分析發現3’末端短1-nt的miRNA異構體在Input組更富集✅，進一步表現出短1-nt的miRNA異構體進入AGO2的效率更低。綜上🙆🏿‍♀️，作者提出5️⃣，在癌細胞中👭🏼，這種短1-nt的異常miRNA雙鏈異構體不能有效地進入到AGO2中🏰，並且不穩定❤️‍🔥，因此可能與不同腫瘤中的miRNA劑量減少有關。

異常的3’末端短1-nt的miRNA異構體在不同的人類腫瘤中廣泛積累

RDR1通過單核苷酸加尾修復癌症中的miRNA異構體

據報道👊🏽，植物RDR6同時具有RNA聚合酶和核苷酸轉移酶活性[7]👨🏽‍🏭，而在後續的小RNA測序數據分析中，作者發現具有3’端單核苷酸加尾的成熟miRNA特異富集於RDR1異位表達的癌症細胞中。有趣的是，這種單核苷酸加尾主要出現在3’末端短1-nt的miRNA上😉，但很少出現在註釋的切割末端上👑。隨後作者在大腸桿菌中純化出重組的rAtRDR1和酶活位點突變的3DA mutant rAtRDR1。通過體外生化實驗🔞，作者直接證明了rAtRDR1能夠對單鏈miRNA和具有1-nt或2-nt懸垂的miRNA雙鏈進行3’末端單核苷酸修飾🐪，但不能修飾具有平末端的miRNA雙鏈🏸。

結合以上的發現🤷🏼‍♀️，作者設想RDR1傾向於識別AGO2中遊離出來的具有1-nt懸垂的miRNA雙鏈作為底物👨🏼‍🎤，這些異構體尤其在癌症細胞中積累，但在非癌症細胞中不積累，並用單核苷酸加尾修飾這些有問題的miRNA。為了驗證這一點👩‍👧‍👧，作者首先在表達RDR1的肺癌A549細胞中進行了AGO2敲低實驗，隨後進行小RNA序列分析🤵🏿。正如預期的那樣，AGO2缺失確實進一步加強了RDR1介導的miRNA修飾，在癌細胞中短1-nt的miRNA異構體上單核苷酸加尾的比例大幅提高。之後，體外將rAGO2與具有1-nt/2-nt懸垂的miRNA雙鏈預孵育後再加入rRDR1進行遊離miRNA雙鏈的加尾實驗🦶🏿🫶🏿，結果顯示與AGO2親和力較低的1-nt懸垂的miRNA雙鏈在與rAGO2蛋白預孵育後更傾向於被RDR1修飾。

最後🕍，作者還通過給1-nt懸垂的miRNA雙鏈加尾後的重新結合，1-nt/2-nt外源miR-34c雙鏈的體外轉染等實驗和分析🔐，共同證明了RDR1擁有核苷酸轉移酶活性，能夠對AGO2中遊離出的短1-nt的miRNA雙鏈異構體進行單核苷酸修飾，以恢復這些異構體對AGO2的裝載效率↩️，並最終修復癌症中有缺陷的miRNA通路。

AGO2缺失可顯著增強癌細胞中RDR1介導的miRNA加尾事件

RDR1更傾向於識別遊離的具有1-nt懸垂的miRNA雙鏈異構體作為底物

RDR1抑製多種小鼠實體瘤和白血病的進展

接下來，作者想在小鼠體內驗證植物RDR1的抗腫瘤作用。首先，作者將RDR1誘導型癌症細胞系註射免疫缺陷小鼠以進行體內荷瘤實驗，並且通過Dox餵水以實現RDR1的異位表達。結果表明，野生型而非突變型RDR1顯著抑製了所成腫瘤的大小🏌🏽‍♀️、體積和重量。作者還發現，在A549🧚🏼‍♂️🤸🏿‍♀️，H1299和PC-3細胞所成的荷瘤中，植物RDR1能夠顯著提高癌細胞中miRNA的表達，從而抑製了癌細胞的細胞周期。

類似的，作者還評估了RDR1在體內白血病小鼠模型中的抗腫瘤作用。與載體對照或突變的RDR1相比，野生型RDR1能夠顯著抑製三種白血病細胞系（Jurkat、K562和NALM6）在免疫缺陷小鼠外周血中的增殖🤶，並最終延長異種移植小鼠的壽命⛹🏻☃️。同樣💁🏿‍♂️，RDR1可以在體內顯著增加白血病細胞中的miRNA表達以抑製白血病細胞中的關鍵細胞周期組分，包括CDK1、CCNE2、PLK1🙎🏽‍♀️、CDK6等📲，從而抑製細胞周期。

最後🙎🏻‍♂️☝🏽，通過納米囊泡包裝體外純化的RDR1蛋白和AAV包裝的RDR1，分別在體外細胞和體內實體瘤水平上實現了RDR1的直接遞送和腫瘤抑製。

AAV遞送的RDR1抑製小鼠體內實體瘤生長

三🕺🏿、抗擊癌症的強大武器

此項研究首次揭示了在各種人類原發性腫瘤中廣泛積累異常的3’末端短1-nt的miRNA異構體，這為理解腫瘤發生過程中全局miRNA劑量的減少提供了新的見解。利用植物免疫蛋白RDR1，意昂官网通過挽救癌細胞中的miRNA缺陷來實現廣譜的抗腫瘤反應👨‍✈️👷🏻‍♂️，並開發了一種新的策略來編輯和操縱miRNA⬛️，使之成為對抗癌症等人類疾病的強大武器🚭。

意昂官网生命科學學院/意昂-清華生命科學聯合中心的杜鵬研究員為該論文的通訊作者。意昂官网前沿交叉學科研究院博士研究生齊燁和生命科學學院博士研究生丁力為本文的並列第一作者🧚🏿‍♀️。意昂官网前沿交叉學科研究院博士研究生張司文參與了部分工作，意昂官网博士姚升澤和博士後翁健莉也對本文有重要貢獻🍎🫰。意昂官网李毅和吳虹教授合作參與完成了這一工作，並給予了大力支持。該項目得到了國家自然科學基金👰‍♀️、意昂官网“細胞增殖與分化”教育部重點實驗室、意昂-清華生命科學聯合中心和意昂-啟東創新基金的資助。